样品：
1 - 40 ug拟南芥Col-0全叶提取物。
2 - 40 ug拟南芥突变体iar4（AT1G24180），拟南芥丙酮酸脱氢酶E1a样亚基。
3 - 40 ug拟南芥突变体iar4l-1（AT1G59900），拟南芥丙酮酸脱氢酶E1a亚基。
4 - 40 ug拟南芥突变体iar4l-2（AT1G59900），拟南芥丙酮酸脱氢酶E1a亚基。
5 - 40 ug拟南芥突变体SALK_004367C（AT5G50850），拟南芥丙酮酸脱氢酶E1组分亚基β-1。T-DNA插入位于AT5G50850的3'UTR区域，因此SALK_004367C可能不是mtPDH-E1b的敲除突变体。
从拟南芥全莲座叶中新鲜提取的总蛋白40 ug/孔。精确的缓冲液成分包括：50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、150 mM NaCl、0.5 mM EDTA、10%（v/v）甘油、1%（v/v）Nonidet P-40（NP-40）、1%（w/v）脱氧胆酸钠、0.1%（w/v）SDS、1 × Complete蛋白酶抑制剂混合物（Roche）、1 mM PMSF，并用5xSDS样品缓冲液（300 mM Tris-HCL(pH 6.8)、10% SDS、0.1%溴酚蓝、50%甘油、500 mM DTT）在95°C/5分钟下变性。样品在室温下在10% SDS-PAGE上分离，并用iBlotu Dry Blotting System（Invitrogen）在室温下转移到硝酸纤维素膜（孔径0.2 um）7分钟。膜用5%牛奶在室温下振荡封闭3小时。然后将膜在2%牛奶中1: 500稀释的一抗中振荡过夜/4°C。弃去一抗溶液，膜简短冲洗两次，然后在室温下振荡用PBS-T洗涤5次，每次5分钟。膜在2%牛奶中1: 5000稀释的匹配二抗（抗兔IgG辣根过氧化物酶偶联）中振荡孵育1小时/室温。膜按前述方法洗涤，并用AS16 ECL-N-10 Agrisera Bright化学发光检测试剂显影。曝光时间为1分钟。
为了提高信噪比，一抗可以使用1: 1000或1: 2000稀释度，在室温下孵育1小时。
感谢瑞士日内瓦大学植物学与植物生物学系的Mengping Li博士提供。ddddddddddddddddd返回搜狐，查看更多
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